Тема: стерилизация и дезинфекция. бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний (1-й день)

Практическое занятие №2.

Тема: Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

Цель: Изучить методы выделения чистых культур бактерий и овладеть бактериологическим методом диагностики инфекционных заболеваний.

Вопросы для самоподготовки:

1.Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования.

2Правила оформления направления на бактериологическое исследование.

3.Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

4.Бактериологический метод диагностики. Цель. Этапы. Диагностическая ценность.

Основные понятия темы.

Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний. Его сущность – определение вида возбудителя инфекции, следовательно, на основании результатов бактериологического метода можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основным недостатком метода является длительность исследования – от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.

Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдение ряда правил.

Забор исследуемого материала необходимо провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы . Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды необходимо соблюдать строжайшую асептику. Для этого использовать стерильный материал: а) ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа); б) проволочную петлю для материала из влагалища, анального отверстия; в) шприц для взятия крови, гноя; г) стерильную посуду для непосредственного сбора в нее мочи, мокроты, испражнений. Транспортировку полученного материала следует производить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах. Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:

фамилия, имя, отчество, возраст пациента; предполагаемый диагноз заболевания; предшествующая антимикробная терапия; характер материала; дата и время взятия материала; цель исследования; название лечебного учреждения, номер отделения, палаты; подпись лечащего врача.

Бактериологический метод осуществляется в два этапа (рис.2.1.):

На первом этапе проводится посев исследуемого материала на твердую или в жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств, отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар. Этап идентификации включает обязательное изучение , свойств и структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучения патогенности и персистентных свойств.

Самостоятельная работа студентов на занятии.

Работа 1

Цель: Освоить бактериологический метод диагностики.

Задача. В бактериологическую лабораторию поступил исследуемый материал (испражнения) от больного с предварительным диагнозом: «Пищевая токсикоинфекция?». При микроскопии материала обнаружены грамположительные кокки и грамотрицательные палочки.

Выделите чистые культуры микроорганизмов, проведите их идентификацию. Определите этиологию пищевой токсикоинфекции.

Методика:

Все этапы бактериологического метода условно осуществляются в течение одного занятия: студент выполняет манипуляции очередного этапа, относит материал в термостат и сразу получает готовый результат для выполнения следующего этапа исследования.

1. Посев исследуемого материала на агар в чашке Петри методом механического разобщения с целью получения отдельных колоний (1-ый день).

Простерилизованной в пламени горелки и охлажденной петлей берут материал для посева и вносят в чашку, слегка приоткрыв крышку. На поверхности питательной среды материал распределяют петлей следующим образом: у края чашки частыми штрихами образуют овальную площадку, на которой остается значительная часть материала, затем проводят параллельные штрихи на расстоянии 0,5 см от одного края чащики к другому. При посеве петлю следует держать параллельно агару, чтобы не царапать его (рис.2.2.а). После рассева петлю вынимают из чашки и немедленно обжигают в пламени, одновременно закрывая чашку Петри крышкой. Чашку маркируют и помещают вверх дном в термостат на сутки.

2.Изучение культуральных свойств выросших колоний (2-ой день).

Через сутки при правильном посеве на последних штрихах вырастают отдельные колонии (рис.2.2.б). Дифференцируют разные типы колоний по величине, цвету (Рис. 2.3.а), форме, прозрачности, характеру поверхности (гладкая, шероховатая) и края (ровный, зазубренный) (рис.2.3.б). Из материала части колоний готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Остаток изучаемой колонии отсевают петлей в пробирку на скошенный питательный агар для получения чистой культуры. Посев ставят в термостат на сутки.

3. Идентификация выделенной чистой культуры (3-ий день).

Через сутки выросшую чистую культуру идентифицируют по основным видовым признакам. Изучают морфологию при микроскопии мазка из чистой культуры. Осуществляют посев чистой культуры на тест-системы (стафитест, энтеротест) для изучения активности. Для этого готовят 1-миллиардную взвесь бактерий в физиологическом растворе, затем дозаторными или пастеровскими пипетками вносят 0,1 мл взвеси в лунки тест-системы. Планшет относят в термостат на сутки.

4. Определение вида выделенных микроорганизмов (4-ый день).

Через 24 часа оценивают результаты биохимической активности по изменению цвета индикатора в лунке и сопоставляют их с таблицами тест-системы. По результатам изучения свойств выделенных чистых культур определяют виды микроорганизмов, что является одной из конечных целей бактериологического метода диагностики. Используют определитель Берджи.

Результат оформляют в виде протокола исследования.

ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ.

26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным методом бактериологического исследования

Изучение свойств микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация.

В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18- 24 часов.

При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.

Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.

При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий - элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.

При бактериологическом методе посев материала на питательные среды производят либо стеклянным или металлическим шпателем, либо бактериальной петлей таким образом, чтобы находящиеся в исследуемом материале бактерии рассеять по поверхности питательной среды. В результате такого рассеивания каждая бактериальная клетка попадает на свой участок среды.

В том случае, если в результате бактериологического метода исследования предполагается в исследуемом материале содержание малого количества возбудителя, посев производят на жидкую питательную среду для его накопления, так называемую среду обогащения, которая оптимальна для данного микроорганизма. Далее осуществляют пересев из жидкой питательной среды на плотные среды, разлитые в чашках Петри. Засеянную возбудителем среду помещают в термостат обычно при определенной температуре, что важно для бактериологического метода.

На втором этапе бактериологического метода исследования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.

Отмечают культуральные свойства колоний: их форму, величину, цвет, характер краев и поверхности, структуру, консистенцию. Далее для приготовления мазков используют часть каждой из намеченных колоний. Окрашивают мазки по Граму, микроскопируют, определяя тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства выделенной культуры и проверяя одновременно ее чистоту.

Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирки с оптимальной для данного вида средой, например, скошенным агаром, с целью накопления чистой культуры для более полного ее изучения. Пробирки перемещают на 18–24 часа в термостат. На втором этапе, кроме перечисленных исследований, нередко подсчитывают количество выросших колоний.

Для того чтобы провести такое исследование готовят последовательные разведения взятого исследуемого материала, из которых на чашки с питательной средой производят высев, подсчитывают количество выросших колоний, умножают на разведение, из чего определяют содержание микроорганизмов в материале.

Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение для этой культуры чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам - третий этап бактериологичестого метода. Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным, токсигенным, антигенным свойствам.

Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре, исследуют морфологию бактерий и проверяют чистоту культуры выросших бактерий. Далее осуществляют посев выделенной чистой культуры бактерий на среды Гисса. Желательно провести посев и на другие среды для определения биохимических свойств.

С помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином in vivo или in vitro определяют токсинообразование микробов. В ряде случаев изучают и другие факторы вирулентности. Вышеперечисленные исследования, которые проводятся в бактериологической лаборатории, позволяют определить род или вид возбудителя.

Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений химический препарат - антибиотик с жидкой питательной средой разводят в пробирках, после чего засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате бактериологического метода исследования для определения идентичности штаммов, полученная антибиотикограмма может служить и эпидемиологическим целям.

Могут проводиться повторные исследования при выявлении бактерионосительства т. к. можно не обнаружить возбудителя в одной порции материала.

Културальн.метод-выдел-е и накопл-е чистой культуры бак-ий с ее послед. Идентиф-ей.Некот.бак-ии обл-ют а\б резистент-ю,поэтому бак.анализ может включать опр-е чув-ти выдел. Чист-к-ры к а\б

Особ-ть: многоэтап-ть. Минус- длит-ть.

Иссл.ж-ти: крови, мочи, спинномозговой жидкости, слизи из зева и носа, кала

Для выдел-я исп-ся плотн.пит среды.Этапы: выдел-е чист.культуры

Методы предв.класиф-ии:

1)морф.анализ бак.колоний и их хар-ка на спец\дифференциальн.средах

2)микроскоп-я окраш бак-ий

Для окончат.индетиф-ии бак-ий: изуч-е б\х акт-ти (биотипирование);

обнаруж-е бак.Аг(серотип-е)-1)р-ция агглютинация на стекле-пр. для энтеробак-ий

2)иммуннодифф-я в агаре (коринебак-ии дифтерии)

опр-е чув-ти к бактериофагам (фаготипир-е)

ИММУНОЛОГИЯ

Антигенраспознающие рецепторы лимфоцитов.

Сравнительная характеристика BCR и TCR

2. Понятие "клонированность" в иммунологии означает:

1. Способность каждого В/Т-лимфоцита реагировать на единственный антиген (эпитоп). 2. Способность каждого В/Т -лимфоцита реагировать на несколько эпитопов. 3. Избирательное связывание антигенных пептидов HLA-молекулами антигенпредставляющих клеток. 4. Специфичность (эпитопная комплементарность) антигенраспознающих рецепторов лимфоцитов. 5. Клоноспецифичность CD-фенотипа Т и В лимфоцитов.

Лимфоциты неоднородны по способности распознавать антигены и реагировать с ними. Более того, каждый лимфоцит и его потомство (клон) настроены на взаимодействие с единственным антигеном (точнее эпитопом). Иными словами, лимфоциты клонированы по чувствительности к антигенам, и именно это определяет избирательность (антигенную специфичность) иммунного ответа. Молекулярной основой клонированности являются особенности рецепторов, связывающих антигены: рецепторы каждого клона уникальны, реагируя только с одним антигеном. Это означает, что число клонов и клоноспецифических рецепторов должно быть огромным, соответствуя необозримому числу потенциальных антигенов. До встречи с антигеном каждый клон представлен небольшим числом зрелых покоящихся клеток (их называют «наивными»). Связываясь с комплементарными рецепторами, антиген обеспечивает активацию лимфоцита, действуя как селекционирующий фактор (селекция клона). Численность клона возрастает (экспансия клона), а входящие в его состав лимфоциты дифференцируются в клетки-эффекторы и клетки-памяти.

БАКТЕРИОЛОГИЯ

3. Признаки микобактерий туберкулеза, связанные с особенностями их клеточной стенки:

1. Кислотоустойчивость. 2. Медленная скорость размножения. 3. Резистентность к фагоцитам. 4. Устойчивость во внешней среде. 5. Высокая чувствительность к антибиотикам.

ТУБЕРКУЛЕЗ . род Micobacterium Родовой признак - кислото, спирто- и щелочеустойчивость. семейство Micobacteriaceae (сапрофиты) отдел Firmicutes. Неподвижные, аэробные гр+ палочковидные бактерии. Иногда образуют структуры, напоминающие мицелий, отсюда название. Для окраски применяют метод Циля-Нильсена. Болезнь вызывается 3 видами микобактерий: Mycobacterium tuberculosis - человеческий вид, Mycobacterium bovis - бычий вид, Mycobacterium africanum - промежуточный вид. [Возбудители микобактериальных антропонозов: M.leprae, m.tuberculosis. возбудитель микобактериального зооноза: M.bovis.] резервуар- больной, путь заражения- аэрогенный. Заболеваемость возрастает всвязи с низким уровнем гигиены, и т.д. Палочка Коха- тонкая, прямая или слегка изогнутая, склонны к ветвлению. Методом Циля-Нильсена окрашиваются в красный цвет,содерж кислотоуст гранулы(зерны Муха в цитопл).нужны факторы роста. В жидких средах синтезирует корд-фактор- фактор вирулентности. Синтезирует много никотиновой кислоты- ниацина(ниацин тест-метод дифферн микобакт). Липиды клеточной стенки: миколовые кислоты, корд-фактор, микозиды, сульфатиды. Поэтому она кислотоустойчива, "бронированное чудовище". Резистентность к фагоцитам, . устойчив во внешн среде. Факторы антифагоцитарной активности: липиды клеточной стенки, сидерофоры.

Патогенез: проникновение в альвеолы; размножение в альвеолярных макрофагах(корд-фактор ингиб фагосомно-лизасомн слияние); формирование неспецифической доиммунной гранулемы(вокруг инфициров клеток формир вал, из макрофаг); проникновение бакт в регионарные лимфатические узлы; индукция Т-клеточного иммунитета; Т-зависимая активация макрофагов(сначала Тхелп усилив биоцидность заражен макрофагов, потом Ткил уничт зараж макроф); формирование специфической постиммунной гранулемы. Заверш процесса-фиброз, кальцификация, формир латент инфекц, форм иммун к экзоген реинфициров-ю. [Инициация процесса- внутримакрофагальная инвазия. Механизмы: неагрессивный фагоцитоз, подавление образования фаголизисом, активное противостояние биотоксическим факторам фаголизосом, подавление функциональной кооперации между макрофагами и Т-лимфоцитами.] Первичн туберкулез-преимущ в детск возрасте проявление(+субфеб темп) - Первичный иммунный комплекс- очаг Гона. В гранулеме клетки Пирогова-Лнгханса, по периметру- лимфоциты, мононуклеары. Возможна реактивация эндогенн инф(вторич тубик) или экзоген реинфекция редко, развивается на фоне аллергии к туберкулопротеинам У лиц с ослабленным иммунитетом возможен диссеминированный туберкулез. Туберкулин- комплекс туберкулопротеинов (белковых дериватов), используется в аллергодиагностике. [Применяют адъювант Фройнда: пептидогликан+липиды клеточной стенки]. Туберкулопротеины обладают имунологически зависимой болезнетворностью, участвуют в реализации протективного иммунитета, используются в аллергодиагностике. Липиды клеточной стенки: антимакрофагальная активность, участвуют в индукции Т-клеточного иммунитета как адъюванты, определяют культуральные и тинкториальные особенности бактерий. Главная функция макрофагов в зоне неспецифической гранулемы: возбуждение реакций клоточного иммунитета. Постиммунная гранулема: возникает на фоне реакции гиперчувствительности замедленного типа к туберкулопротеинам, зона для функциональной кооперации между макрофагами и Т-эффекторами, основа для деструктивных реакций, основа для саногенеза(выздоровл), завершается бессимптомной персистенцией возбудителя. Деструкт процессы при туберкул определ-ся: имуннологически опосредованные эффекты микобакт АГ, цитокин-зависимая актифация макрофагов, аллергия к туберкулопротеинам. Иммунитет Противотуберкулезный иммунитет нестерильный инфекционный, [обусловлен наличием в организме L-форм микобактерий.]клеточный, антибактериалн

Лаб диагн. К обязательным методам обследования относится бактериоскопическое, бактериологическое исследование, биологическая проба, туберкулинодиагностика, основанная на определении повышенной чувствительности организма к туберкулину(очишен смесь белков возбуд туб-а). Чаще для выявления инфицирования и аллергических реакций ставят внутрикожную пробу Манту с очищенным туберкулином в стандартном разведеНИИ(до 14 лет). Флюрографию. Лечение-антибиотикотерап, хирур вмешат.

Специфическую профилактику проводят путем введения живой аттенуир вакцины - BCG(БЦЖ), внутрикожно на 5-й день после рождения ребенка. Проводят последующие ревакцинации7, 13лет.

ВИРУСОЛОГИЯ

4. Гемагглютинин ортомиксовирусов:

1. Инициирует взаимодействие вируса с клеткой. 2. Обретает активность после ограниченного протеолиза. 3. Фактор слияния. 4. Протективный антиген. 6. Имеется у всех типов (видов) рода Influenza.

Ортомиксовирусы Род Influenzavirus семейства orthomixoviridae(слизь, те сродство с муцином). Различают 3 типа-А,В,С.«-»РНК (8 сегментов,однонитевая это А и В, 7 у С) Подобная сегментарность позволяет двум вирусам при взаимодействии легко обмениваться генетической информацией и тем самым способствует высокой изменчивости вируса., спиральный нуклеокапсид(сост из рнк, нуклеопротеина(структур и регулят роль и типоспец аг) и протеина), суперкапсид-есть(=» сложные). Белки(ферменты) рнк-полимеразн комплекса: белок РВ1(транскриптаза), белок РВ2(эндонуклеаза), белок РА(репликаза). Далее идет М-белок(участв в сборке вирус частиц, типоспецеф АГ), далее билипидный слой(формир из мембраны клет хозяина, чувств к эфиру)из котор гликопротеинов шипы, сост из геммаглютинина(Н) и нейроминидазы(N(у типа С нет ее))

АГ-ая структура: внутренние - NP, белок-М, белки РНК полимераз комплекса. Наружные – Н(разновид 15, у чел:Н1-3) и N(9, у чел:N1,N2). Репликация ч/з иРНК.

(транскриптаза, эндонуклеаза, репликаза). Репл в ядре и синтез

Путем эндоцитоза чз Н в эндосому, там кислая среда меняет конформацию, обнажает пептиды(F-белки) вызывающие слияние вирусной и фаголизосомальной мембраны =>депротенизация

Дрейф, шифт. вирусемия. Ремантадин.

Признаки: -РНК(=>она не может без транскрипц выполнять функции иРНК, фрагментарна), оболочечн(к внутр относят М-белок,нуклеопрот,ферм полимер компл)., возбуд ОРЗ, нуклеокапсид спирал сим. Дел-е на виды: (А,В,С) АГ-особ-ти внутр белков(нуклеопротина). А, В, С различ по: эколог, масштаб АГ-изм-ти, спектр вирион ферм, степ Эпидем-ти(лидер по патаген – вирус типа А, тип В промежуточ, тип С-служит причин спорадическ заболев те единичн вспышки). Белки суперкапс: N, H. H: инициир взаимод вир с Кл(тк имеет сродство к сиалированным гликопептидам и гликолипидам благодаря этому вирионы закрепл на плазм мемб), актив-ся протеолизом(синтез в виде предшест кот способ реагир с рецепт клет, но не обеспеч слияния вирион оболо с клеточ мембр=> должен пройти огранич протеолиз, протеазы расщепл геммаглют на H1и H2и после допол конформации в кисл среде эндосом, Н2инициир пр слияния) , ф-р слияния(способ выходу нуклекапсида в цитоплазм:в кисл среде эндосом, обнажаются специал структ гемаглют(сайты слияния) кот возбужд объединен вирусн и клеточ мембран), протект-АГ(те к нему ат блокир вирус и подавл инфекцию), у всех видов Influenza., Нейраминидаза: протективн аг,фактор распространения(те расширяет зону инфекции путем отщепления сиаловой кислоты от гликолепидов и гликопептидов те по сути инактивирующий рецепторы для гемагглютинина), отлич эпитопн изменчив. АГ-шифт(это сдвиг, неожиданный, скочкообраз кот ведет к полной смене антиген профиля Н,N и появлен новых субтипов): только тип А, экологич детерминир-н(привязка вирусов к респират тракту), генетич детерменир(зависит от генетич рекомбин генов при одновр заражении клет нескол штаммами),смена субтипов пов белк вириона, возн пандемии(Н1N1(это испанка)H3N2(вирус Гонконг) . Дрейф(медленн частичное обнавление с помощ точечн мутаций Н,N-эпитопов при сохранен антиген родства с поверх АГ родительск штамма, определяет штаммовые особенности внутри субтипа, дает начало штаммом с повышен эпидем проходимостью) эпид. Трудно вакцину получ: АГ- изм-ть, дрейф.

Экзаменационный билет 58.

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Понятие о специфической профилактике инфекционных заболеваний. Иммунологические основы вакцинопрофилактики. Работы Э Дженнера и Л.Пастера. Типы вакцин (убитые, живые, субъединичные; моно- и ассоциированные). Рекомбинантные вакцины, принцип получения. Конъюгированные вакцины. Мукозальные вакцины.

Иммунитет бывает пассивный(1.естествен приобрет-после инфекции и 2.искуств приобрет-после вакцины) и активный(1.естеств приобрет-АТ мамы через молоко или плаценту и 2.искусст приобрет-серотерапия). Неспецифическая проф-ка направлена на избежание зарадения, а специфическая напрвлена против конкрерт возбуд-й. Сущность вакцинации-сформировать память об АГ,что обеспечит быстрый иммун ответ. Для вакцины нужны только протективные АГ(т.е. которые выз-т выработку АТ)

ИСТОРИЯ:в 1778г в Дженнер доказал,что прививка «коровьей оспы» защ-т от зар-я натуральной оспой. Это был продукт чистого эксперимента. Это дата рождения вакцинологии. Сам термин «вакцина» дал Пастер. Он в 1881 «осознанно» ослабил вирулентноть бакт,культивируя их в неблагопр усл. Он приготовил первые вакцины против куринной холеры и сибирской язвы. В 885 он получил вакцины против беш-ва(позже оказадась,что это была убитая вакцины)

Типы вакцин:

1. ЖИВЫЕ- вводят ослабленных(аттенуированных) бакт. Осл-т физич,химич способами. «+»-высок иммуногенность и длительность эфф-та(тк ослабл бакт способны разм-ся в орг-ме,персистировать «-»- повыш реактогенность,нестабильность,ничтожная. Но вероятность реверсии вирулентного фенотипа. Пример:BCG

2. УБИТЫЕ-сод-т инактивир бакт,прост,грибы или вирионы. Их недостатки и достоинства противоположны живым вакцинам. Нужно чаще проводить. Пример: п-в гриппа,брюш тифа

3.СУБЪЕДИНИЧНЫЕ–состоят из очищенных протективных АГ. Реактогенность минимальна. О изкая имуногенность,которую усил с пом адьювантов

1) Конъюгированные- исп-т для созд-я имм-та против Т-независ АГ. Т-независ АГ не ост-т памяти.

2)Анатоксины-обезвреженные токсины бактерий. Проблема связана с тем,что моноинтокцикация редко встречаеться. Экзотоксины обрабатывают формалином и те теряют токсич св-ва, но сох-т иммун-ть. Они не предох-т от бактерионосительства. Пример: столбячий анатоксин

3)Рекомбинантные-это рекомбинантные молекулы ДНК,сделан на основе бактер плазмид,в кото встроены гены протективных АГ. Такие ДНК синт-т АГ, индуцирующ гуморальн и клечный имм.

1)Голые-спольз свободн плазмиды или те,что сорбированы на искуст носителях. Они безопасны. Пример: пртив гепатита В

2)Векторные-для доставки применяют ослабл бакт

4.МУКОЗАЛЬНЫЕ-создаются специально для имм-та слизист оболочек против инфекций респират,кишеч и полового трактов. Помисо д-я на месте они влияют и на общий имм-т. Их обязательно сопр-т адьюванты. Но их ведрение в практику идет оч медленно

9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний

Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.

Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.

Бактериологический метод исследования включает:

1. посев исследуемого материала в питательные среды

2. выделение чистой культуры

3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:

I этап (работа с нативным материалом)

Цель: получение изолированных колоний

1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре

2. Подготовка материала к исследованию

3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов

II этап

Цель: получение чистой культуры

1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

2. Микроскопическое изучение изолированных колоний

3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).

4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

III этап

Цель: идентификация выделенной чистой культуры

1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:

морфология и тинкториальные свойства

культуральные свойства (характер роста на питательных средах)

биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)

серологические свойства (антигенные)

вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)

патогенность для животных

фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)

чувствительность к антибиотикам

другие индивидуальные свойства

IV этап (Заключение)

По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре

Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.

При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.

Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.

Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырас­тает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изу­чают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).

Таблица 11. Схема изучения колоний

Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.

Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют неболь­шое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).

Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для это­го из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).

При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые куль­туры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.

Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического поло­жения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаим­ного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия куль­тивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием про­межуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).

Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.

Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают проб­ку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.

Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут про­бирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.

При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки.

Заключение

Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.

Исследование бактерий имеет большое практическое значение для человека. На сегодняшний день открыто большое количество прокариот, которые отличаются друг от друга по патогенности, области распространения, форме, размерам, количеству жгутиков и другим параметрам. Чтобы детально изучить данный штамм, применяется бактериологический метод исследования.

Какие существуют методы клеток?

Чтобы определить, являются ли бактерии патогенными, проводят исследование культуры различными способами. Среди них:

1. Бактериоскопический метод.

2. Бактериологический метод.

3. Биологический метод.

Бактериоскопический и бактериологический основаны непосредственно на работе с клетками прокариот, когда биологический анализ требуется для изучения влияния таких клеток на живой организм подопытных животных. По степени проявления тех или иных признаков заболевания ученый может сделать вывод о наличии или отсутствии патогенных бактерий в пробе, а также естественно их размножить в организме животного для получения их культуры и использования в других работах.

Бактериологический метод исследования отличается от бактериоскопического. В первом для анализа используется специально подготовленная культура живых прокариот, когда во втором проводится работа с мертвыми или живыми клетками на предметном стекле.

Этапы бактериологического метода исследования. Микробиология

Принцип изучения свойств бактериальной культуры может пригодиться как для ученых-микробиологов, которые поставили цель исследовать прокариотические клетки, так и для лаборантов, задача которых заключается в установлении патогенности или непатогенности бактерий, а затем диагноза пациента.

Методика изучения бактерий делится на три этапа:

1. Выделение бактерий из первоначальной пробы.

2. Высевание бактерий и выращивание изучение ее свойств.

Первый этап

Проба, или мазок, берется со свободной поверхности среды или у пациента. Таким образом мы получаем «коктейль» из множества видов бактерий, которые должны высеять на питательную среду. Иногда появляется возможность выделить сразу необходимые бактерии, зная их очаги распространения в организме.

Через двое-трое суток отбираются нужные колонии и высеваются на твердые среды чашек Петри с помочью стерильной петли. Во множестве лабораторий работают с пробирками, где может находиться твердая или жидкая питательная среда. Так и проводится бактериологический метод исследования в микробиологии.

Второй этап

После получения отдельных колоний бактерий проводится непосредственный макро- и микроанализ. Измеряются все параметры колоний, определяется цвет и форма каждой из них. Нередко проводится подсчет колоний на чашке Петри, а затем в исходном материале. Это имеет значение при анализе патогенных бактерий, от числа которых зависит степень заболевания.

Бактериологический метод исследования, 2 этап которого заключается в изучении отдельных колоний микроорганизмов, может быть сопряжен с биологическим способом анализа бактерий. Еще одна цель работы на этом этапе - увеличить количество исходного материала. Это можно сделать на питательной среде, а можно провести эксперимент в естественных условиях на живых подопытных организмах. Патогенные бактерии будут размножаться, и в результате кровь будет содержать миллионы клеток прокариот. Из взятой крови легко приготовить необходимый рабочий материал бактерий.

Третий этап

Самая важная часть исследования - это определение морфологических, биохимических, токсигенных и антигенных свойств культуры бактерий. Работа ведется с заранее «очищенными» культурами на питательной среде, а также с препаратами (зачастую окрашенными) под микроскопом.

Установить принадлежность патогенных или условно-патогенных бактерий к той или иной систематической группе, а также определить их устойчивость к лекарствам позволяет бактериологический метод исследования. 3 этап - антибиотики, т. е. анализ поведения клеток бактерий в условиях содержания лекарственных препаратов в окружающей среде.

Исследование устойчивости культуры к антибиотику имеет важное практическое значение, когда необходимо прописать для конкретного пациента необходимые, а главное, действенные препараты. Здесь и может помочь бактериологический метод исследования.

Что такое питательная среда?

Для развития и размножения бактерии должны находиться в заранее подготовленных питательных средах. По консистенции они могут быть жидкие или твердые, а по происхождению - растительные или животные.

Основные требования к питательным средам:

1. Стерильность.

2. Максимальная прозрачность.

3. Оптимальные показатели кислотности, активности воды и других биологических величин.

Получение изолированных колоний

1. Метод Дригальского. Он заключается в том, что на бактериальную петлю наносится мазок с различными видами микроорганизмов. Этой петлей проводят по первой чашке Петри с питательной средой. Далее, не меняя петлю, методом остаточного материала проводят по второй и третьей чашкам Петри. Так, на последних образцах колонии бактерии будут засеваться не слишком плотно, тем самым упрощается возможность найти необходимые для работы бактерии.

2. Метод Коха. В нем используются пробирки с расплавленной питательной средой. Туда помещается петля или пипетка с мазком бактерий, после чего содержимое пробирки выливается на специальную пластинку. Агар (или желатин) застывает через какое-то время, а в его толще легко обнаружить нужные колонии клеток. Важно перед началом работы развести смесь бактерий в пробирках, чтобы концентрация микроорганизмов не была очень большой.

Этапы которого основаны на выделении нужной культуры бактерий, не обходится без этих двух способов нахождения изолированных колоний.

Антибиотикограмма

Визуально реакцию бактерий на препараты можно заметить двумя практическими способами:

1. Метод бумажных дисков.

2. Разведение бактерий и антибиотика в жидкостной среде.

Метод бумажных дисков требует наличия культуры микроорганизмов, которые были выращены на твердой питательной среде. На такую среду кладут несколько бумажек округлой формы, пропитанных антибиотиками. Если препарат успешно справляется с нейтрализацией бактериальных клеток, после такой обработки останется участок, лишенный колоний. Если же реакция на антибиотик отрицательная, бактерии выживут.

В случае использования жидкой питательной среды сперва готовят несколько пробирок с культурой бактерий разных степеней разведения. В эти пробирки добавляют антибиотики, и в течение суток наблюдают за процессом взаимодействия вещества и микроорганизмов. В конечном итоге получается качественная антибиотикограмма, по которой можно судить об эффективности препарата для данной культуры.

Основные задачи анализа

Здесь перечислены по пунктам цели и этапы бактериологического метода исследования.

1. Получить исходный материал, который будет использоваться для выделения колоний бактерий. Это может быть мазок с поверхности любого предмета, слизистой оболочки или полости органа человека, анализ крови.

2. на твердой питательной среде. Через 24-48 часов на чашке Петри можно обнаружить колонии бактерий разных видов. Отбираем по морфологическим и/или биохимическим критериям нужную и проводим уже с ней дальнейшую работу.

3. Размножение полученной культуры. Бактериологический метод исследования может опираться на механический или биологический способ увеличения численности культуры бактерии. В первом случае ведется работа с твердыми или жидкими питательными средами, на которых в термостате размножаются бактерии и образуют новые колонии. Биологический способ требует естественных условий увеличения численности бактерий, поэтому здесь микроорганизмами заражается подопытное животное. Через несколько суток в пробе крови или мазке можно обнаружить множество прокариот.

4. Работа с очищенной культурой. Чтобы определить систематическое положение бактерий, а также их принадлежность к возбудителям заболеваний, необходимо провести тщательный анализ клеток по морфологическим и биохимическим признакам. При исследовании патогенных групп микроорганизмов важно знать, насколько эффективно действие антибиотиков.

Это была общая характеристика бактериологического метода исследования.

Особенности проведения анализа

Главное правило проведения бактериологического исследования - это максимальная стерильность. Если идет работа с пробирками, посевы и пересевы бактерий должны проводиться только над нагретой спиртовкой.

Все этапы бактериологического метода исследования требуют использования специальной петли или пастеровской пипетки. Оба инструмента должны быть предварительно обработаны в пламени спиртовки. Что касается пастеровской пипетки, то тут перед термической стерилизацией необходимо отломать кончик пипетки пинцетом.

Техника посева бактерий тоже имеет свои особенности. Во-первых, при посеве на твердые среды проводят бактериальной петлей по поверхности агара. Петля, конечно же, уже должна иметь на поверхности образец микроорганизмов. Также практикуется посев внутрь и в этом случае петля или пипетка должны достичь дна чашки Петри.

При работе с жидкими средами используются пробирки. Здесь важно следить, чтобы жидкости не касались краев лабораторной посуды или пробки, а используемые инструменты (пипетка, петля) не дотрагивались до посторонних предметов и поверхностей.

Значение биологического метода исследования

Анализ пробы бактерий имеет свое практическое применение. Прежде всего бактериологический метод исследования может использоваться в медицине. К примеру, необходимо изучить микрофлору больного, чтобы установить правильный диагноз, а также выработать правильный ход лечения. Здесь помогает антибиотикограмма, которая покажет активность лекарственных препаратов против возбудителя заболеваний.

Анализ бактерий используется в лаборатории для определения таких опасных заболеваний, как туберкулез, возвратный тиф или гонорея. Также он применяется для изучения бактериального состава миндалин, полостей органов.

Бактериологический метод исследования можно использовать для определения загрязненности среды. По данным о количественном и качественном составе мазка с поверхности какого-либо предмета определяется степень заселенности данной среды микроорганизмами.