Что такое агрегация тромбоцитов в анализе крови. Преимущества анализатора агрегации тромоцитов

Анализ на агрегацию тромбоцитов предназначается для того, чтобы исследовать агрегации тромбоцитов и иных клеток, определять в суспензии концентрации клеток и оценивать их формы. Регистрируется агрегация и турбидометрическим способом, и недавно разработанным способом, который основывается на оценке средних размеров агрегатов.

Анализатор агрегации тромбоцитов - что это

Турбидометрический способ анализатора агрегации тромбоцитов в настоящее время при исследованиях агрегации тромбоцитов является более распространенным. В его основе лежит регистрация изменений светопропускания плазмы, обогащенной тромбоцитами. Это позволяет проводить исследования не только агрегации, но также и изменений формы тромбоцитов. Изменение формы с другой стороны маскирует начальный этап агрегации. Помимо этого, показано, что на светопропускании суспензии образование малых агрегатов может не сказываться.

Также существует другой метод агрегации тромбоцитов, основанный на анализе флуктуаций светопропускания, которые вызваны случайным изменением в оптическом канале количества частиц. Отличается этот метод агрегации тромбоцитов высокой чувствительностью, благодаря чему он пригоден для исследований спонтанной агрегации, агрегации макромолекул и субклеточных частиц, агрегации под влиянием низких концентраций индукторов.

Преимущества анализатора агрегации тромоцитов

Развитие такого методического подхода позволило проводить измерения концентрации частиц в суспензии. Анализатор агрегации тромбоцитов поставляют в комплекте с программным обеспечением. Такая программа позволяет проводить:

• Автоматическую калибровку прибора;
• Сохранять на диске результаты записей с сопроводительной информацией;
• Осуществлять одновременный вывод для просмотра и печати любое число снятых ранее агрегатограмм;
• Делать статическую обработку одновременно нескольких кривых;
• Экспортировать результаты в пригодном для последующей обработки виде;
• Определить концентрацию тромбоцитов и иных клеток, контролируя при этом параметры среды и оценивая точность и достоверность полученных результатов.

Применяются:

• Для оценки эффективности терапии;
• В токсикологии;
• Для скрининга атерогенности липопротеидов;
• При диагностике состояний тромбоцитарного звена гемостаза;
• При диагностике приобретенных и врожденных нарушений гемостаза;
• Для скрининга новых лекарственных препаратов;
• Для оценки при переливании крови жизнеспособности тромбоцитарной массы.

Норма агрегации тромбоцитов по анализатору

Норма соответствует 25-75 процентам. Не редко бывают отклонения от нормы.

Повышенную агрегацию сопровождает ишемическая болезнь сердца и развитие инфаркта миокарда.

Сочетается аномальная агрегация с такими состояниями:

• Недостаток белков плазмы, который обеспечивает взаимодействие со стенками сосудов тромбоцитов;
• Нарушения тромбоцитов, спровоцированные дефицитами высвобождения АДФ, мест хранения и гликопротеиновых мембранных рецепторов;
• Наличие аномальных компонентов и метаболитов плазмы при синдроме внутрисосудистого диссеменированного свертывания, диспротеинемии, уремии;
• Сосудистые расстройства;
• Тромбастения Гланцманна (отсутствие при влиянии тромбина, адреналина, коллагена, АДФ агрегации, при действии ристоцетина нормальная агглютинация);
• Миелопролиферативные расстройства (миелоидная хроническая лейкемия, истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия);
• Синдром Бернара-Сулье (нормальная агрегация под влиянием адреналина, коллагена, АДФ, недостаток агглютинации под влиянием ристоцетина. При действии ристоцетина агглютинация отличается тем, что при добавлении нормальной плазмы она не корригируется.
• Дефицит циклооксигеназы (аспирино-подобный дефект, аномальная агрегация из-за неспособности активирования пути простагландина);
• Дефицит мест хранения (синдром серых тромбоцитов, гликогеноз типа I – аномальная агрегация бывает зачастую из-за снижения или отсутствия вторичного высвобождения АДФ);
• Агрегация тромбоцитов норма снижается (прием больших доз фуросемида, индометацина, ацетилсалициловой кислоты);
• Болезнь фон Виллебранда (при влиянии адреналина, коллагена, АДФ нормальная агрегация, снижение или отсутствие агглютинации при влиянии ристоцетина (исключая тип IIB, где при субнормальной концентрации ристоцетина осуществляется агглютинация).

В настоящее время все шире используются определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью автоматических счетчиков крови, или гематологических анализаторов. Эти аппараты точны, и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин). Подсчет тромбоцитов проводят согласно инструкции к аппарату. Бюджетные модели гематологических анализаторов определяют только количество тромбоцитов, а более совершенные приборы содержат полный анализ тромбоцитарного звена, и позволяют говорить о морфологии тромбоцитов. Развернутый анализ тромбоцитов на анализаторе позволяет определить такие показатели:

· РLТ - количество тромбоцитов. Норма от 150-400*10 9 /л; При выходе за эти пределы необходима микроскопия мазка.

· MPV - средний объем тромбоцитов. «Молодые» тромбоциты имеют больший объем. MPV увеличивается с возрастом. Норма: 8-10 фл

· PDW ширина распределения тромбоцитов по объему отражает степень анизоцитоза тромбоцитов. Норма = 14-16%.

· РСТ – тромбокрит, доля объема цельной крови, занимаемая тромбоцитами (аналогичен гематокриту). Норма = 0,15-0,40%.

Также гематологический анализатор строит график распределения тромбоцитов по размеру:

Рис. 2. Распределение тромбоцитов по объему.

Количество тромбоцитов в крови здорового человека колеблется в пределах 150-400 ×10 9 /л.

Снижение числа тромбоцитов (<150 ×10 9 /л) – тромбоцитопения – может наблюдаться при следующих патологических и физиологических состояниях:

· острый ДВС-синдром;

· острый лейкоз и миелодиспластические синдромы;

· гипо- и апластические анемии;

· нарушение образования в организме тромбоцитопоэтина;

· химиотерапия и лучевая терапия;

· тромботическая тромбоцитопеническая пурпура и гемолитико-уремический синдром;

· спленомегалия и гепатолиенальный синдром;

· гепарин-индуцированная тромбоцитопения;

· эклампсия и преэклампсия;

· экстракорпоральное кровообращение;

· гемодиализ у больных с хронической почечной недостаточностью, гемосорбция;

· интенсивная трансфузионная терапия;

· пароксизмальная ночная гемоглобинурия;

· иммунные формы патологии (СКВ и др. коллагенозы, АФС, иммунная тромбоцитопеническая пурпура);

Повышение числа тромбоцитов (>400 ×10 9 /л) – тромбоцтоз – наблюдается в следующих случаях:

· мегакариоцитарные и миелолейкозы,

· эритремия;

· вторичный, реактивный тромбоцитоз в случае спленэктомии (через 1-3 недели),

· внутриполостные кровоизлияния после оперативных вмешательств,

· спустя 7-10 дней от начала подострого токсико-инфекционного ДВС-синдрома,

· после перенесенного острого кровотечения,

· при злокачественных новообразованиях (предвестник опухоли легкого, поджелудочной железы)

· других причинах хронического ДВС-синдома.

Нормальное количество тромбоцитов может не обеспечивать полноценный гемостаз при нарушении функциональных свойств тромбоцитов - тромбоцитопатиях. Поэтому также исследуют функциональные свойства тромбоцитов способность к спонтанной и индуцированной агрегации различными индукторами (агонистами) агрегации: АДФ, коллагеном, ристоцетином и т. д. Для исследования функциональных свойств тромбоцитов используют плазму богатую тромбоцитами.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ

1. Внутренняя среда организма. Эритроциты: строение, функции.

2. Эритропоэз: стадии и характеристики предшественников.

3. Регуляция эритропоэза: витамины и микроэлементы.

4. Регуляция эритропоэза: эритропоэтины и микроокружение.

5. Эритремия: этиология, патогенез, симптомы, принципы лечения.

6. Анемия: определение, симптомы, терапия.

7. Классификация анемий по цветовому показателю.

8. Классификация анемий по степени тяжести и по регенераторным способностям.

9. Этиологическая и патогенетическая классификация анемий.

10. Тромбоцитопоэз: стадии и характеристики предшественников.

11. Методы подсчета количества тромбоцитов: подсчет в камере Горяева.

12. Методы подсчета количества тромбоцитов: в тонком мазке крови.

13. Методы подсчета количества тромбоцитов: на гематологическом анализаторе. Тромбоцитарные показатели.

14. Тромбоцитопения: определение, причины.

15. Тромбоцитоз: определение, причины. Тромбоцитопатии.

Артикул: АГ02003/LA 230

Основные особенности:

• Новый высокочувствительный метод исследования агрегации - измерение среднего радиуса - позволяет регистрировать кинетику образования малых агрегатов в реальном времени
• Чувствительность при измерении спонтанной агрегации выше, чем у прибора Бреддина
• Два независимых канала; в каждом канале светопропускание и средний радиус агрегатов измеряются одновременно
• Результаты измерений могут регистрироваться с помощью встроенного дисплея или компьютера

Области применения:

• Диагностика состояния тромбоцитарного звена гемостаза
• Диагностика врожденных и приобретенных нарушений гемостаза
• Оценка эффективности терапии
• Скрининг новых лекарственных препаратов
• Оценка жизнеспособности тромбоцитарной массы при переливании крови
• Токсикология

Анализаторы агрегации НПФ БИОЛА предназначены для исследования агрегации тромбоцитов и других клеток, определения концентрации клеток в суспензии, а также оценки их формы. Агрегация регистрируется как традиционным турбидометрическим методом, так и недавно разработанным методом, основанным на оценке среднего размера агрегатов в реальном времени.

Турбидометрический метод, предложенный Борном и О\"Брайеном, является в настоящее время наиболее распространенным при исследовании агрегации тромбоцитов. Он основан на регистрации изменений светопропускания обогащенной тромбоцитами плазмы. Это позволяет исследовать не только агрегацию, но и изменение формы тромбоцитов. С другой стороны, изменение формы может маскировать начальный этап агрегации. Кроме того, показано, что образование малых агрегатов (менее 100 тромбоцитов) может не сказываться на светопропускании суспензии. В 1989 году З.А. Габбасовым и соавторами был предложен новый метод исследования агрегации тромбоцитов.

Метод основан на анализе флуктуаций светопропускания (ФСП-метод), вызванных случайным изменением числа частиц в оптическом канале. Относительная дисперсия таких флуктуаций пропорциональна среднему размеру агрегатов, и используется для исследования кинетики агрегации. Метод отличается высокой чувствительностью, что делает его пригодным для исследования спонтанной агрегации, агрегации под действием низких концентраций индукторов, а также агрегации субклеточных частиц и макромолекул. Развитие этого методического подхода позволило также измерять концентрацию частиц в перемешиваемой суспензии.

В комплекте с анализаторами агрегации поставляется программное обеспечение. Программа выполняется на IBM-совместимом компьютере в среде Windows. Она отображает кривые агрегации в ходе эксперимента, сохраняет их вместе с временными метками и сопроводительной информацией на диске, и позволяет в дальнейшем их просматривать и обрабатывать.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ТРОМБОЦИТОВ В КРОВИ

Микроскопический метод подсчета

Чаще всего используется метод подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т. е. с фазово-контрастной приставкой. Мало точен и не может быть рекомендован метод подсчета тромбоцитов в мазке крови.

В настоящее время все шире используются определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью автоматических счетчиков крови. Эти аппараты точны и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин).

Принцип. Производится подсчет тромбоцитов в камере Горяева с применением в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости раствора оксалата аммония . При подсчете используют фазово-контрастную микроскопию.

Реактивы. 1% раствор оксалата аммония.

Ход определения. Исследование можно проводить как в крови, полученной из пальца, так и в стабилизированной цитратом венозной крови. В последнем случае полученный при подсчете результат умножают на коэффициент 1,1 (учитывают разведение венозной крови раствором цитрата натрия - 9:1).

Разведение крови. Самым удобным и достаточно точным является способ разведения крови в пробирках (не в меланжере). Для этого, в предварительно высушенную чистую силиконированную или пластиковую (полистирол) пробирку пипеткой отмеривают 1,98 мл 1% оксалата аммония и осторожно вносят в нее 0,02 мл крови. В течение 1-2 мин содержимое пробирки тщательно перемешивают без вспенивания. Заполняют две камеры Горяева и на 10-15 мин помещают их для оседания тромбоцитов во влажную камеру (чашку Петри со смоченной фильтровальной бумагой или марлей). В каждой камере подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах.

Фазово-контрастная микроскопия проводится при помощи обычного микроскопа, осветителя типа ОИ-19 (или аналогичного) и устройства для наблюдения методом фазового контраста КФ-1 или КФ-4.

Подготовка микроскопа. После установки на микроскопе фазовых объективов и фазового конденсора производят фокусировку объективов 40х на сетке камеры Горяева. Устанавливают освещение и центрируют изображение фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы. Микроскопию проводят с зеленым светофильтром. При работе с фазово-контрастной установкой необходимо пользоваться камерами одного типа, так как фокусировка оптических систем зависит от толщины стекла камеры.

Расчет определения числа тромбоцитов в 1 мкл крови. Среднюю арифметическую величину из двух параллельных определений умножают на 1000 (площадь 25 больших квадратов - 1 мм2, высота камеры - 0,1 мм, разведение 1:100; следовательно, количество тромбоцитов должно быть умножено на1 х10х100 = 1000).

Нормальные пределы колебаний числа тромбоцитов в крови у человека составляют от 170 до 350 х 109/л. Ошибка метода ± 6,5%.

Подсчет тромбоцитов в крови и определение их размера в мазке - важная часть диагностики тромбоцитопений, эссенциальной и полицитемической тромбоцитемии, ДВС-синдрома, тромботической тромбоцитопенической пурпуры и других микротромбоваскулитов, нарушений гемостаза при аутоимунных формах патологии (СКВ, антифосфолипидном синдроме и др.) и при гепатолиенальном синдроме. При наследственных тромбоцитопатиях наблюдаются формы с микроцитозом (синдром Вискотта-Олдрича) и преобладанием гигантских форм кровяных пластинок (аномалии Бернара-Сулье и Мей-Хегглина), а также формы без изменения размеров этих клеточных элементов.

Идиопатическая (аутоиммунная) тромбоцитарная пурпура

Аутоантитела против неизмененных антигенов тромбоцитов больного

Гаптеновая (гетероимунная) тромбоцитопения

Гаптеновые аутоантитела против измененных или чужеродных антигенов на поверхности тромбоцитов

Лекарственная тромбоцитопения

Антитела против комплекса лекарства (хинин, гепарин) с тромбоцитарным антигеном

Тромбоцитопения, ассоциированная с вирусной инфекцией

Антитела против вирусных антигенов, фиксированных на поверхности тромбоцитов, или против измененных тромбоцитарных антигенов

Аллоиммунная тромбоцитопения

Аллоантитела против аллоантигенов тромбоцитов плода или переливаемых тромбоцитов

Неонатальная аллоиммунная тромбоцитопеническая пурпура

Аллоантитела матери, проникшие в организм плода. Направлены против аллоантигенов тромбоцитов плода и отца, отсутствующих на тромбоцитах матери

Повышение количества PLT в крови - тромбоцитоз - характерно для миелопролиферативных заболеваний. Тромбоцитоз наблюдается также при злокачественных новообразованиях, после операций, при воспалительных заболеваниях (острый ревматизм, ревматоидный артрит , туберкулез, остеомиелит), после спленэктомии, циррозе печени, кровотечениях, в период выздоровления при мегалобластных анемиях , лечении кортикостероидами, остром гемолизе, физических перенапряжениях.

Тромбоцитозы

Средний объем тромбоцита (МРV)

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов. MPV увеличивается с возрастом. У мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагулянта вызывает изменение формы тромбоцитов от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличиваться, а при высокой концентрации (1:4) - не изменяется со временем. Кроме типа применяемого антикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние температура окружающей среды. Преходящее увеличение MPV отмечается у рабочих, контактирующих с асфальтовыми испарениями, органическими растворителями. MPV - важный диагностический показатель функции тромбоцитов.

PDW - показатель, являющийся мерой гетерогенности размеров (анизоцитоза) тромбоцитов. Величина PDW в среднем составляет 10-15%.

Как артефакт, ложно завышенное увеличение PDW может быть связано с присутствием микроцитов, шизоцитов, микроагрегатов тромбоцитов, фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

Этот показатель находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов и их периода жизни. В каждом конкретном случае важна не только величина PDW, но и ее динамика во времени, а также связь с другими тромбоцитарными показателями. Так, увеличение PDW с одновременным снижением MPV свидетельствует о преобладании микротромбоцитов среди общей популяции тромбоцитов (указывает на угнетение тромбоцитопоэза), а сочетание повышенного PDW с увеличением MPV отражает нарастание числа макротромбоцитов (усиление продукции тромбоцитов). Одновременное присутствие фракций макротромбоцитов и микротромбоцитов ведет к увеличению PDW, но MPV может оставаться в пределах нормы. В современных гематологических анализаторах отдельными показателями указывается процентное содержание микротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбоцитов (MacroPLT).

PDW может применяться для дифференциальной диагностики. Так, увеличение PDW свыше 15% было обнаружено у 50% больных эссенциальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с реактивным тромбоцитозом и лишь у 14% здоровых людей.

РСТ - показатель, характеризующий процент тромбоцитарной массы в объеме крови: вычисляется суммированием прямо измеренных объемов тромбоцитов или произведением среднего объема тромбоцитов на их число.

У здорового человека показатель стремится остаться стабильным: при уменьшении числа тромбоцитов усиливается тромбопоэз, в циркулирующую кровь выбрасывается большее число молодых макротромбоцитов, что ведет к увеличению MPV. При увеличении количества циркулирующих тромбоцитов снижается продукция их в костном мозге, тем самым уменьшается процент макротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако при нарушении этого равновесия происходит или уменьшение РСТ, что, в конечном счете, приводит к патологии первичного гемостаза и риску возникновения кровотечений, или повышение РСТ, увеличивающее активность тромбоцитов и их способность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

Нормальные значения РСТ варьируют в пределах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что снижение РСТ менее 0,1% обусловило возникновение послеоперационных кровотечений у пациентов с развившейся тромбоцитопенией. Также было отмечено, что этот показатель оказался более чувствительным для оценки риска возникновения кровотечения, чем число тромбоцитов.

Если скрининговые методы указывают на нарушение функции тромбоцитов, необходимо выполнить специальные тесты с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых пациентом (отмена за 7-10 суток перед исследованием глюкокортикостероидов, аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств, адреноблокаторов, блокаторов кальциевых каналов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаверина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина, антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).

Методы определения длительности кровотечения

Длительность кровотечения является скрининговым тестом для выявления нарушений первичного гемостаза. Метод основан на определении времени кровотечения из нанесенной на поверхности кожных покровов небольшой ранки стандартного размера. Это время зависит от способности сосудисто-тромбоцитарных гемостатических механизмов останавливать кровотечение из поврежденных мелких сосудов и капиллляров и поэтому его продолжительность может характеризовать состояние первичного гемостаза. Оно может быть нарушено вследствие дефектов сосудистого звена, неполноценности функциональных свойств кровяных пластинок или дефицита/дефекта плазменных кофакторов тромбоцитарных реакций (фибриногена, фактора Виллебранда), выраженной тромбоцитопении. При снижении числа тромбоцитов менее 100x109/л имеется прямая связь между степенью тромбоцитопении и удлинением времени кровотечения. Длительность кровотечения коррелирует также с геморрагическими тенденциями при тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда. Увеличение времени кровотечения наблюдается и при тяжелой анемии (Ht<0,20) из-за нарушения участия эритроцитов в процессе первичного гемостаза.

Помимо решения диагностических задач тест рекомендуется проводить для контроля за эффективностью применяемой гемостатической терапии, для своевременного выявления угрозы геморрагических осложнений при проведении дезагрегационной терапии. Длительность кровотечения должна быть определена у больного в период предоперационной подготовки, т. к. значительная часть больных с патологией тромбоцитарного звена гемостаза имеет скрытую форму заболевания, которая тем не менее дает тяжелые кровотечения в ходе операции и после нее.

В настоящее время используют в основном два принципа при определении длительности кровотечения; проведение теста в условиях, не затрудняющих течение первичного гемостаза, и в условиях, препятствующих его осуществлению.

К первым методам относится тест Duke , при выполнении которого колотую ранку глубиной 3,5 мм наносят скарификатором в нижней части мочки уха; выступающие капли крови осторожно, не прикасаясь к раневой поверхности, снимают фильтровальной бумагой через 15-30 с. Регистрируют время от момента нанесения укола до прекращения кровотечения, которое в норме не превышает 4 мин. Тест малочувствителен и не позволяет выявить нарушения при тромбоцитопатиях легкой и средней тяжести.

Наиболее распространенными за рубежом методами определения длительности кровотечения второй группы являются различные модификации метода Ivy, который предложил проводить исследование на верхней конечности в условиях веностаза, затрудняющего сосудистые реакции.

Определение длительности кровотечения по методу Айви

Принцип метода

Оценивают длительность кровотечения после разреза кожи предплечья скарификатором с глубиной разреза 3 мм. Стандартизация метода достигается равной глубиной кожного разреза и созданием венозного стаза путем повышения венозного давления до 40 мм рт. ст. при помощи сфигмома-нометра, что предупреждает эффект преждевременного склеивания краев раны.

Реактивы и оборудование

70% раствор этанола.

Сфигмоманометр.

Скарификатор, способный осуществить разрез кожи глубиной 2-3 мм.

Ход выполнения

Сфигмоманометр накладывают на плечо, нагнетают в нем давление, равное 40 мм рт. ст., и поддерживают такое давление в течение всего исследования.

Ладонную поверхность предплечья обрабатывают раствором этанола.

Натягивают кожу предплечья в поперечном (по отношению к костям предплечья) направлении.

Скарификатором наносят три разреза кожи по 5-10 мм (направление разреза должно быть перпендикулярно натяжению кожи предплечья, т. е. параллельно костям предплечья) глубиной 3 мм и включают секундомер.

Капли крови осторожно удаляют фильтровальной бумагой путем ее смачивания через каждые 15-30 с.

Регистрируют время остановки кровотечения из каждой ранки.

Снижают давление в манжете сфигмоманометра.

Вычисляют средний результат длительности кровотечения для каждого из трех разрезов.

Существует несколько схожих методов для оценки длительности кровотечения , однако метод Айви отличается от аналогичных неплохой воспроизводимостью и малой травматичностью. В оригинальном исполнении нормальное время кровотечения не превышает 8 мин, однако указанный норматив условен, поскольку результаты определения длительности кровотечения этим методом значимо варьируют в зависимости от варианта скарификатора и опыта исследователя, поэтому необходимо уточнить нормативы для каждой лаборатории. При тромбоцитопениях, тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда длительность кровотечения часто удлинена, а при изолированных дефектах коагуляцион-ного гемостаза (гемофилии и др.) длительность кровотечения не отличается от нормы.

Причины ошибок

Нестандартный скарификатор, неглубокий (менее 3 мм) разрез кожи, недостаточная квалификация лаборанта.

Исследование агрегационной функции тромбоцитов

Принцип метода

Тромбоциты способны агрегировать под воздействием различных субстанций, называемых индукторами (стимуляторами) агрегации (АДФ, адреналин , арахидоновая кислота, тромбин, кальциевый ионофор А23187, коллаген , фибрин-мономер, бычий коагуляционный фактор VIII, ристоцетин и др.). Изучение агрегационной функции тромбоцитов осуществляют при помощи специального прибора - агрегометра. В основе записи агре-гатограммы этим прибором - принцип Борна, который предполагает графическую регистрацию выраженности уменьшения оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы в процессе агрегации тромбоцитов. В случае нарушения агрегационной функции тромбоцитов происходит незначительное изменение оптической плотности, что и регистрирует этот прибор.

Забор крови и подготовка плазмы для исследования

После пункции локтевой вены самотеком кровью наполняют пластиковую или силиконированную пробирку, в которую предварительно добавлен раствор цитрата натрия (соотношение объемов крови и цитрата натрия равно 9:1). Затем пробирку тщательно и аккуратно (без встряхивания) перемешивают в течение 2-3 минут.

Материалом для исследования является бедная тромбоцитами плазма.

БТП получают в два этапа. На первом этапе получают богатую тромбоцитами плазму, для чего цитратную кровь центрифугируют в течение 7 минут при 240 g. На втором этапе богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют в течение 15 минут при g.

Реактивы и оборудование

0,11 М раствор цитрата натрия (Na3C6H507).

Агрегометр с компьютером и принтером.

Стимуляторы агрегации (АДФ, адреналин, коллаген и др.). В табл. 12 представлены оптимальные конечные концентрации наиболее распространенных стимуляторов агрегации тромбоцитов.

Таблица. Оптимальные конечные концентрации стимуляторов агрегации тромбоцитов

Для проведения анализа предварительно необходимо подсчитать число тромбоцитов на гематологическом анализаторе или микроскопическим методом.

Ход определения

Материалом для исследования является богатая тромбоцитами плазма, но для калибровки прибора необходима еще и бедная тромбоцитами плазма.

Поскольку при разном числе тромбоцитов необходимы разные концентрации индукторов агрегации, следует приготовить богатую плазму с одинаковым числом тромбоцитов для всех образцов (исследуемых и контрольных). Для стандартизации числа тромбоцитов следует развести богатую тромбоцитами плазму бедной таким образом, чтобы число тромбоцитов стало равным 150-300 х 109. Например, число тромбоцитов 600 х 109, поэтому исследуемую богатую тромбоцитами плазму необходимо развести бедной тромбоцитами плазмой этого же больного в 2 раза. Таким образом, на первом этапе исследования очень важно определить число тромбоцитов.

Для записи агрегатограммы любому агрегометру необходимо определить оптическую плотность и ряд других параметров в исследуемых образцах, поэтому компьютерный алгоритм агрегометра будет требовать установить в измерительные гнезда пробирки с бедной и богатой тромбоцитами плазмами.

В кювету агрегометра вносят 0,3 мл богатой тромбоцитами плазмы (со стандартным числом тромбоцитов 150-300 х 109), инкубируют пробирку в гнезде для измерения в течение 60-120 с для нагрева богатой тромбоцитами плазмы до 37 °С, затем включают магнитную мешалку, добавляют 0,015 мл раствора индуктора агрегации. В момент добавления индуктора агрегации включают запись регистрации агрегации*.

Оценка результатов исследования

Существует много способов оценки агрегатограмм, но наиболее информативно измерение степени агрегации и угла наклона, поскольку неплохую воспроизводимость демонстрируют именно эти показатели. Их нормальный диапазон зависит от большого числа причин (марки агрегометра, используемых реагентов, числа тромбоцитов, конечной концентрации индуктора, скорости вращения магнитной мешалки и многих других), поэтому общепринятых диапазонов нормы при измерении агрегационной функции тромбоцитов нет. Это вынуждает врачей-лаборантов уточнять нормативы самостоятельно.

Применение низких концентраций стимуляторов агрегации дает возможность оценить раздельно первую и вторую волны агрегации. Большую ценность имеет информация о наличии или отсутствии второй волны агрегации, поскольку именно вторая волна на агрегатограмме отражает реакцию высвобождения содержимого тромбоцитарных гранул (плотных и а-гранул). Весьма полезно при записи агрегации тромбоцитов использовать несколько стимуляторов агрегации. При наличии геморрагического синдрома и отсутствии нарушений агрегации тромбоцитов необходимо повторно выполнить исследование через 1-1,5 месяца. И наоборот, при наличии специфичных изменений агрегации для болезни Бернара-Сулье, тромбастении Гланцманна и другой патологии необходимо повторно исследовать агрегационную функцию тромбоцитов.

Причины ошибок

Тест очень чувствителен к дефектам преаналитического этапа. Даже минимальный недостаток цитрата натрия вследствие низкого гематокрита ведет к значительным погрешностям и невоспроизводимым результатам.

Последовательность манипуляций и объемы смешиваемых реагентов могут отличаться для разных типов агрегометров.

Для исследования агрегации необходимо использовать специальные иглы для пункции кубитальной вены, которые способны наполнить кровью пробирки с цитратом натрия самотеком. Забирать кровь шприцом нельзя.

Некачественная обработка магнитных мешалок и пробирок ведет к грубым ошибкам. Существенную помощь в обработке лабораторной посуды оказывают ультразвуковые мойки.

Неточный замер прибором оптической плотности богатой и бедной тромбоцитами плазмы также приводит к ошибкам. Подобный дефект возможен при наличии царапин на пробирках.

Неточное определение числа тромбоцитов и, как следствие, исследование образца плазмы с нестандартным числом тромбоцитов является причиной ошибок.

Варианты результатов записи агрегации тромбоцитов методом Борна при различных вариантах нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.

При тромбоцитопатиях может быть нарушена агрегация с одним (обуславливая так называемую парциальную тромбоцитопатию) или разными индукторами агрегации.

Иногда диагностические трудности возникают при дифференциальной диагностике болезни Виллебранда и болезни Бернара-Сулье, поскольку варианты нарушений при исследовании агрегационной функции тромбоцитов при этих состояниях одинаковы. В этом случае помогает добавление в исследуемую богатую тромбоцитами плазму нормальной БТП или крио-преципитата. Эта простая модификация восстанавливает ристомициновую агрегацию у больных с болезнью Виллебранда, но не исправляет нарушение агрегации при болезни Бернара-Сулье.