Распределение бжу в течение дня. Методы выделения белков

Живой организм, обладающий уникальной структурной организацией обеспечивающей его фенотипические признаки и биологические функции, в своем структурно-функциональном единстве опирается на белковые тела (белки). Это философско-теоретическое представление, основанное на сравнительно небольших достижениях естествознания своего периода, было выдвинуто Ф.Энгельсом, который в своих трудах отмечал, что "Повсюду, где мы встречаем жизнь, мы находим, что она связана с каким-либо белковым телом, и повсюду, где мы встречаем какое-либо белковое тело, не находящееся в процессе разложения, мы без исключения встречаем и явления жизни" (цит. Энгельс Ф. Анти-дюринг. 1950, с.77).

Развитие представлений о белковых веществах

Представление о белках, как о классе соединений, формировалось в XVIII-XIX вв. В этот период из разнообразных объектов живого мира (семена и соки растений, мышцы, хрусталик глаза, кровь, молоко и т. п.) были выделены вещества, обладающие сходными свойствами: они образовывали вязкие, клейкие растворы, свертывались при нагревании, при их высушивании получалась роговидная масса, при "анализе огнем" ощущался запах паленой шерсти или рога и выделялся аммиак. Беккари, выделивший в 1728 году первое белковое вещество из пшеничной муки, назвал его "клейковиной". Он же показал его сходство с продуктами животного происхождения, а поскольку все эти сходные свойства были известны для яичного белка, то новый класс веществ получил название белков.

Важную роль в изучении структуры белков сыграло развитие методов их разложения кислотами и пищеварительными соками. В 1820 г. А. Браконно (Франция) подвергал многочасовому действию серной кислоты кожу и другие ткани животных, затем нейтрализовал смесь, получал фильтрат, при выпаривании которого выпадали кристаллы вещества, названного им гликоколом ("клеевым сахаром"). Это была первая аминокислота, выделенная из белков. Ее структурная формула установлена в 1846 г.

В 1838 г., после систематического изучения элементарного состава разных белков, в которых были обнаружены углерод, водород, азот, кислород, сера и фосфор, голландский химик и врач Г. Я. Мульдер (1802-1880) предложил первую теорию строения белков - теорию протеина. Исходя из исследований элементного состава, Мульдер пришел к выводу, что все белки содержат одну или несколько групп ("радикалов") С 40 Н 62 N 10 O 2 , соединенных с серой или фосфором или с тем и другим вместе. Он предложил для обозначения этой группы термин "протеин" (от греч. protos - первый, важнейший), так как считал, что это вещество "без сомнения, важнейшее из всех известных тел органического царства, и без него, как кажется, не может быть жизни на нашей планете" (Цит. по кн.: Шамин А. Н. История химии белка. М.: Наука, 1977. С. 80.). Представление о существовании такой группы скоро было опровергнуто, а значение термина "протеины" изменилось, и сейчас он применяется как синоним термина "белки".

Дальнейшие исследования позволили к концу XIX в. выделить из белков свыше десятка аминокислот. Исходя из результатов изучения продуктов гидролиза белков А.Я. Данилевский первым предположил существование в белках связей -NН-СО-, как в биурете и в 1888 году выдвинул гипотезу строения белка, получившую название "теории элементарных рядов", а немецкий химик Э. Фишер, совместно с Гофмейстером, получившим в 1890 г. кристаллический белок - яичный альбумин, предложил в 1902 г. пептидную теорию строения белков.

В результате работ Э. Фишера стало ясно, что белки представляют собой линейные полимеры аминокислот, соединенных друг с другом амидной (пептидной) связью, а все многообразие представителей этого класса соединений могло быть объяснено различиями аминокислотного состава и порядка чередования разных аминокислот в цепи полимера. Однако эта точка зрения не сразу получила всеобщее признание: еще в течение трех десятилетий появлялись иные теории строения белков, в частности такие, которые основывались на представлении, что аминокислоты не являются структурными элементами белков, а образуются как вторичные продукты при разложении белков в присутствии кислот или щелочей.

Дальнейшие исследования были направленные на определение молекулярной массы белков с использованием ультрацентрифуги, сконструированной в 1925-1930 гг. Сенгером и получения белков в кристаллическом виде, являющимся надежным доказательством чистоты (гомогенности) препарата. В частности, в 1926 г. Д. Самнер выделил из семян канавалии белок (фермент) уреазу в кристаллическом состоянии; Д. Нортроп и М. Кунитц в 1930-1931 гг. получили кристаллы пепсина и трипсина.

В 1951 г. Полинг и Кори разработали модель вторичной структуры белка, названной альфа-спиралью. В 1952 г. Линдерстрём-Ланг предположил существование трех уровней организации белковой молекулы: первичный, вторичный, третичный. В 1953 г. Сенгер впервые расшифровал последовательность аминокислот в инсулине. В 1956 г. Мур и Стейн создали первый автоматический анализатор аминокислот. В 1958 г. Кендрью и в 1959 г. Перутц расшифровали трехмерные структуры белков - миоглобина и гемоглобина. В 1963 г. Цан синтезировал природный белок инсулин.

Таким образом, широко известное положение о природе жизни: "Жизнь есть способ существования белковых тел", сформулированное Ф. Энгельсом постепенно получало достоверное научное подтверждение.

В настоящее время абсолютно достоверно установлено, что белки (белковые вещества) составляют основу и структуры и функции всех живых организмов, для которых характерны широкое разнообразие белковых структур и их высокая упорядоченность; последняя существует во времени и в пространстве. Удивительная способность живых организмов к воспроизведению себе подобных также связана с белками. Сократимость, движение - непременные атрибуты живых систем - имеют прямое отношение к белковым структурам мышечного аппарата. Наконец, жизнь немыслима без обмена веществ, постоянного обновления составных частей живого организма, т. е. без процессов анаболизма и катаболизма (этого удивительного единства противоположностей живого), в основе которых лежит деятельность каталитически активных белков - ферментов.

По образному выражению одного из основоположников молекулярной биологии Ф. Крика, белки важны прежде всего потому, что они могут выполнять самые разнообразные функции, причем с необыкновенной легкостью и изяществом. Подсчитано, что в природе встречается примерно 10 10 -10 12 различных белков, обеспечивающих существование около 10 6 видов живых организмов различной сложности организации, начиная от вирусов и кончая человеком. Из этого огромного количества природных белков известны точное строение и структура ничтожно малой части - не более 2500. Каждый организм характеризуется уникальным набором белков. Фенотипические признаки и многообразие функций обусловлены специфичностью объединения этих белков, во многих случаях в виде надмолекулярных и мультимолекулярных структур, в свою очередь определяющих ультраструктуру клеток и их органелл.

В клетке Е.coli содержится около 3000 различных белков, а в организме человека насчитывается свыше 50000 разнообразных белков. Самое удивительное, что все природные белки состоят из большого числа сравнительно простых структурных блоков, представленных мономерными молекулами - аминокислотами, связанными друг с другом в полипептидные цепи. Природные белки построены из 20 различных аминокислот. Поскольку эти аминокислоты могут объединяться в самой разной последовательности, то они могут образовать громадное количество разнообразных белков. Число изомеров, которое можно получить при всевозможных перестановках указанного числа аминокислот в полипептиде исчисляется огромными величинами. Так, если из двух аминокислот возможно образование только двух изомеров, то уже из четырех аминокислот теоретически возможно образование 24 изомеров, а из 20 аминокислот - 2,4 x 10 18 разнообразных белков.

Нетрудно предвидеть, что при увеличении числа повторяющихся аминокислотных остатков в белковой молекуле число возможных изомеров возрастает до астрономических величин. Ясно, что природа не может позволить случайных сочетаний аминокислотных последовательностей, и для каждого вида характерен свой специфический набор белков, определяемый, как теперь известно, наследственной информацией, закодированной в молекуле ДНК живых организмов. Именно информация, содержащаяся в линейной последовательности нуклеотидов ДНК, определяет линейную последовательность аминокислот в полипептидной цепи синтезируемого белка. Образовавшаяся линейная полипептидная цепь сама теперь оказывается наделенной функциональной информацией, в соответствии с которой она самопроизвольно преобразуется в определенную стабильную трехмерную структуру. Таким образом, лабильная полипептидная цепь складывается, скручивается в пространственную структуру белковой молекулы, причем не хаотично, а в строгом соответствии с информацией, содержащейся в аминокислотной последовательности.

Наиболее богаты белковыми веществами ткани и органы человека и животных. Большинство этих белков хорошо растворимы в воде. Однако некоторые органические вещества, выделенные из хряща, волос, ногтей, рогов, костной ткани - нерастворимые в воде - также были отнесены к белкам, поскольку по своему химическому составу оказались близки к белкам мышечной ткани, сыворотки крови, яйца. Количественное содержание белков в различных тканях и органах человека приведено в табл. 1.1. В мышцах, легких, селезенке, почках на долю белков приходится более 70-80% сухой массы, а во всем теле человека до 45-50 % сухой массы.

Источником белка являются также микроорганизмы и растения. В отличие от животных тканей в растениях содержится значительно меньше белков (табл. 2).

Распределение белков между субклеточными структурами неравномерно: больше всего их в клеточном соке (гиалоплазме) (таб. 3). Содержание белков в органеллах определяется скорее размерами и количеством органелл в клетке.

Для изучения химического состава, строения и свойств белков их обычно выделяют или из жидких тканей, или из богатых белками органов животных, например сыворотки крови, молока, мышц, печени, кожи, волос, шерсти.

Белок и его характерные признаки

Элементный состав белков (таб. 4.) в пересчете на сухое вещество представлен 50-54% углерода, 21-23% кислорода, 6,5-7,3% водорода, 15-17% азота, 0,3-2,5 серы и до 0,5% зола. В составе некоторых белков открываются также в небольших количествах фосфор, железо, марганец, магний, йод и др.

Таким образом, помимо углерода, кислорода и водорода, входящих в состав почти всех органических полимерных молекул, обязательным компонентом белков является азот, в связи с чем белки принято обозначать как азотсодержащие органические вещества. Содержание азота более или менее постоянно во всех белках (в среднем 16%), поэтому иногда определяют количество белка в биологических объектах по количеству белкового азота: массу азота, найденную при анализе, умножают на коэффициент 6,25 (100: 16 = 6,25). Но для некоторых белков этот признак нетипичен. Например, в протаминах содержание азота достигает 30%, поэтому только по элементному составу нельзя точно отличить белок от других азотсодержащих веществ организма.

Таким образом, учитывая элементарный состав, белками называют высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, состоящие из аминокислот, соединенных в цепи с помощью пептидных связей, и имеющие сложную структурную организацию. Это определение объединяет характерные признаки белков, среди которых можно выделить следующие:

• довольно постоянная доля азота (в среднем 16% от сухой массы);
• наличие постоянных структурных звеньев - аминокислот;
• пептидные связи между аминокислотами, с помощью которых они соединяются в полипептидные цепи;
• большая молекулярная масса (от 4-5 тысяч до нескольких миллионов дальтон);
• сложная структурная организация полипептидной цепи, определяющая физико-химические и биологические свойства белков.

Структурные звенья, или мономеры, белков можно обнаружить после гидролиза: кислотного (HCl), щелочного (Ba(OH) 2) или/и реже ферментативного. Этот прием наиболее часто используют для изучения состава белков. Установлено, что при гидролизе чистого белка, не содержащего примесей, освобождается до 20 различных α-аминокислот L-ряда, которые являются мономерами белков. В белках аминокислоты соединяются в цепь ковалентными пептидными связями.

α-аминокислоты представляют собой производные карбоновых кислот, у которых один водородный атом, у α-углерода, замещен на аминогруппу (-NH 2), например:

Молекулярная масса белков . Важнейшим признаком белков является большая молекулярная масса. В зависимости от длины цепи все полипептиды условно можно разделить на пептиды (содержат от 2 до 10 аминокислот), полипептиды (от 10 до 40 аминокислот) и белки (свыше 40 аминокислот). Если принять среднюю молекулярную массу одной аминокислоты около 100, то молекулярная масса пептидов приближается к 1000, полипептидов - до 4000, а белков - от 4-5 тыс. до нескольких миллионов (таб. 5.)

Сложная структурная организация белков . Некоторые природные полипептиды (состоящие, как правило, из одной аминокислоты) и искусственно полученные полипептиды имеют большую молекулярную массу, но отнести их к белкам нельзя. Отличить их от белков помогает такой уникальный признак, как способность белков к денатурации, т. е. потеря характерных физико-химических свойств и, главное, биологических функций, при действии веществ, не разрывающих пептидные связи. Способность к денатурации свидетельствует о сложной пространственной организации белковой молекулы, отсутствующей у обычных полипептидов.

Изучение физико-химических свойств, химического состава и структуры возможно только при исследовании очищенного белкового препарата. Для выделения и фракционирования индивидуальных белков используются: высаливание, осаждение органическими растворителями, гельфильтрация, электрофорез, ионообменная хроматография, аффинная хроматография.

Высаливание белков основано на зависимости растворимости белка от свойств среды. В дистиллированной воде протеины растворяются хуже, чем в слабых растворах солей, так как низкие концентрации ионов поддерживают их гидратные оболочки. Но при высоких концентрациях соли молекулы белка теряют гидратные оболочки, агрегируют и образуется осадок. После удаления соли белки вновь переходят в раствор, сохраняя нативные свойства и конформацию.

Изменение растворимости при различных концентрациях соли и рН среды используется для выделения индивидуальных белков. Чаще всего для высаливания белков используют растворы сульфата аммония разной концентрации.

Осаждение белков из раствора без их денатурации осуществляют с помощью дегидрирующих агентов - органических растворителей (этанол, ацетон).

Гель-фильтрация основана на разделении белков по величине и форме молекулы. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных гранулами пористого геля (сефадекса, агарозы), в буферном растворе с определенным значением рН. Гранулы геля проницаемы для белков благодаря внутренним каналам (порам) с определенным средним диаметром, размер которого зависит от типа геля (сефадекс G-25, G-200 и т.д.). Смесь белков вносят в колонку и затем вымывают (элюируют) буферным раствором с определенным значением рН. Крупные молекулы белка не проникают в поры геля и перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем. Мелкие молекулы низкомолекулярной примеси (соли) или другого белка удерживаются гранулами геля и вымываются из колонки медленнее (рис. 1.29). На выходе колонки раствор (элюат) собирают в виде отдельных фракций.

Рис. 1.29. Разделение белков методом гель-фильтрации

Электрофорез основан на свойстве заряженных молекул белка перемещаться в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие при данном значении рН суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду, а положительный - к катоду. Электрофорез проводят на разных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. Скорость перемещения зависит от заряда, массы и формы молекул белка. После завершения электрофореза зоны белков на носителе окрашивают специальными красителями (рис. 1.30, А).

Разрешающая способность электрофореза в геле выше, чем на бумаге, так при электрофорезе белков сыворотки крови на бумаге выделяют 5 фракций (альбумины, α 1 -, α 2 -, β-, γ-глобулины), а в полиакриламидном геле - до 18 фракций (рис. 1.30, Б).

Рис. 1.30. Электрофореграмма белков сыворотки крови здорового человека

А - электрофореграмма белков сыворотки крови на бумаге;

Б - количество белков плазмы разных фракций.

I - γ-глобулины; II - β-глобулины; III - а 2 -глобулины;

IV - а 1 -глобулины; V - альбумины

Ионообменная хроматография основана на разделении белков, отличающихся суммарным зарядом. Раствор белка с определенным значением рН пропускают через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым сорбентом, при этом часть белков задерживается в результате электростатического взаимодействия. В качестве сорбента используют ионообменные вещества: анионообменники (содержащие катионные группы) для выделения кислых белков; катионообменники (содержащие анионные группы) для выделения основных белков.

При пропускании белка через колонку прочность его связывания с ионообменником зависит от величины заряда, противоположного заряду сорбента. Адсорбированные на ионообменном сорбенте белки элюируют буферными растворами с различной концентрацией соли и рН, получая разные фракции белков.

Аффинная хроматография основана на специфичности связывания белка с лигандом, присоединенным к твердому носителю. В качестве лиганда используются субстраты ферментов, простетические группы холопротеинов, антигены и т.д. При пропускании через колонку смеси белков к лиганду присоединяется только комплементарный протеин (рис. 1.31, А), все остальные выходят вместе с раствором. Адсорбированный белок элюируется раствором с другим значением рН (рис. 1.31, Б). Этот метод высокоспецифичен и позволяет получать белковые препараты высокой степени очистки.

Выделение и очистка белка обычно проходят в несколько стадий с использованием различных методов. Последовательность стадий подбирается эмпирическим путем и может различаться для разных протеинов. Высокая степень очистки белков очень важна как при использовании их в качестве лекарственных препаратов (гормон инсулин и т.д.), так и при диагностике различных заболеваний по изменению белкового состава тканей, крови, слюны и др.

Набор белков в клетках различных органов взрослого человека индивидуален и поддерживается относительно постоянным на протяжении жизни. Специализированные ткани могут содержать специфические белки, например гемоглобин в эритроцитах, актин и миозин в мышцах, родопсин в сетчатке глаза, разные типы коллагена в костной и соединительной тканях. Некоторые белки содержатся во многих тканях, но в разных количествах. Отдельные изменения состава

Рис. 1.31. Разделение белков методом аффинной хроматографии

А - связывание выделяемого белка со специфическим лигандом, присоединенным к нейтральному носителю; Б - получение раствора индивидуального белка

белков тканей и крови возможны и связаны прежде всего с режимом питания, составом пищи, физической активностью человека.

При заболеваниях белковый состав крови и клеток тканей может существенно изменяться, часто развивается недостаточность какого-либо белка либо снижение его активности - протеинопатия. Поэтому определение выраженных изменений белкового состава крови и тканей используется для диагностики различных заболеваний в клинических исследованиях.

Здравствуйте, дорогие друзья! Расскажу, как правильно распределить белки, жиры и углеводы в дневном рационе. В здоровом питании важно не только выбор потребляемых продуктов и их количество. Полезно разбираться в вопросе, когда эти продукты лучше есть.

В разные часы тело человека исполняет разные биохимические процессы. Так, утром активность проявляют гормоны стресса, а ближе к вечеру на передовую выходят гормоны сна.

Белки, жиры и углеводы – наши базовые нутриенты – перерабатываются организмом по-разному. И во многом, назначение их различно. Давайте посмотрим, какому времени суток отдает предпочтение каждый нутриент.

На заметку! Я не раз писала, что мой рацион состоит из 5-6 небольших приемов пищи. Это наиболее оптимальный в большинстве случаев план, чтобы не перегружать пищеварительный тракт и не чувствовать голода.

Когда есть углеводы?

Углевод прежде всего выполняет энергетическую задачу. Это лучший нутриент для восстановления сил и это – калории. Утренние гормоны стресса стимулируют физическую активность, благодаря чему сжигание калорий более активное.

Отсюда следует, что львиную долю углеводов лучше есть в первой половине дня – это завтрак и обед. Углеводами являются каши, крупы, макароны, мучное, а также фрукты и овощи. Однако последние часто рекомендуют на полдник и ужин. Почему?

Продукты с большим количеством углеводов имеют много крахмала и клетчатки (крупы, картофель, бобовые и зерновые), поэтому их надо есть в первой половине дня. А овощи и фрукты – это в основном клетчатка и вода, поэтому калорий в них мало. Из можно на полдник или ужин.

Вывод: калорийные углеводы (в составе которых крахмал и клетчатка) лучше есть на завтрак, первый перекус и обед. Это зерновые, крупы, картофель, сладкое, мучное. Низкокалорийные углеводы, состоящие из клетчатки, можно есть и во второй половине дня. Это фрукты и овощи.

Когда есть жиры?

Жиры могут в некоторых случая стать заменой углеводу в качестве источника энергии. Но только в одном приеме пищи. Распределить жиры можно на протяжении всего дня. Поскольку для здорового функционирования этого нутриента не нужно слишком много, то жиры и так «разбегутся» понемногу на каждый прием.

Стоит учесть, если прием пищи высокоуглеводный, то жиров нужно есть меньше. Если же в блюде в основном белки – то можно добавить больше жиров.

Вывод: жиры могут стать единоразовой энергетической заменой углеводам. Если в блюде много углеводов, то жиров должно быть меньше. Если приём пищи – белковый, то можно увеличить количество жиров. Учитывая предпочтительное время для углеводов, получается, то утром жиров нужно меньше, а вечером – больше.

Когда есть белки?

Для переваривания белков требуется больше энергии, чем на углеводы и жиры. И, учитывая, что в вечернее время метаболизм у нас замедляется, белок будет очень кстати, чтобы поддерживать этот процесс на должном уровне.

Белок – это строительный материал, потребность в котором растет в конце дня, для восстановления мышц и обновления тканей.

Учитывая, что для переваривания белка нужны и жиры, и углеводы, целесообразно распределить эти нутриенты на все приемы пищи с приоритетом на ужин.

Вывод: белки нужно распределить на все приемы пищи, но в разных количествах. На протяжении всего дня с утра и к вечеру доля белковых продуктов должная расти, а углеводных — уменьшаться. Самым белковым приемом пищи будет ужин.

Время фруктов

В свежем виде фрукты лучше есть отдельно от основных приемомв пищи, то есть на перекус. А в дополнение к обеду или ужину – не лучший выбор. Это обяъсняется тем, что свежие фрукты вместе с другой едой задерживаются в тракте, начинается спиртовое брожение, затруднение переваривания.

Но фрукты, прошедшие термическую обработку, перевариваются вместе с другой едой без проблем. Так, если потушить, например, яблоки с мясом, то фруктовые кислоты при нагревании разрушатся.

Подводим итог

Для здорового рациона нужно правильно распределить белки, жиры и углеводы на приемы пищи в течение дня.

1. В первой половине дня (завтрак, перекус, обед) едим углеводы с небольшим добавлением белков и жиров. То есть крупы, бобовые, злаки, зерновые, фрукты и сладости.
2. Во второй половине дня вступают белки и клетчатка. Это нежирное мясо и рыба, молочная продукция, овощи.
3. На каждый прием пищи должна приходиться небольшая доля жиров.

высаливание : осаждение солями щелочных, щелочноземельных металлов (хлорид натрия, сульфат магния), сульфатом аммония; при этом не нарушается первичная структура белка;

осаждение : использование водоотнимающих веществ: спирт или ацетон при низких температурах (около –20 С).

При использовании этих методов белки лишаются гидратной оболочки и выпадают в осадок в растворе.

Денатурация - нарушение пространственной структуры белков (первичная структура молекулы сохраняется). Может быть обратимая (структура белка восстанавливается после устранения денатурирующего агента) или необратимая (пространственная структура молекулы не восстанавливается, например, при осаждении белков минеральными концентрированными кислотами, солями тяжелых металлов).

Методы разделения белков Отделение белков от низкомолекулярных примесей

Диализ

Используют специальную полимерную мембрану, которая имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом, белки отмывают от примесей.

Разделение белков по молекулярной массе

Гель-хроматография

Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки (рис. 2.1). Размер белка зависит от его молекулярной массы.

Рис. 2.1. Разделение белков методом гель-фильтрации

Ультрацентрифугирование

Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия) (рис. 2.2).

Рис. 2.2. Разделение белков методом ультрацентрифугирования

Электрофорез

Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда.

Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют бóльшие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, бóльшие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие (рис. 2.3).

Рис. 2.3 . Разделение белков методом электрофореза в геле

Методом электрофореза можно разделить белки и по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na) .

Выделение индивидуальных белков

Аффинная хроматография

Метод основан на способности белков прочно связываться с различными молекулами нековалентными связями. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков.

Молекулы веществ (лиганды), с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного вещества. Смесь белков вносят в колонку, и искомый белок прочно присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии лиганд. Этот высокочувствительный метод позволяет выделить в чистом виде очень малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков.

Изоэлектрофокусирование

Метод основан на различной величине ИЭТ белков. Белки разделяют методом электрофореза на пластине с амфолином (это вещество, у которого заранее сформирован градиент pH в диапазоне от 3 до 10). При электрофорезе белки разделяются в соответствии со значением их ИЭТ (в ИЭТ заряд белка будет равен нулю, и он не будет передвигаться в электрическом поле).

Двухмерный электрофорез

Представляет собой сочетание изоэлектрофокусирования и электрофореза с ДДС-Na. Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении на пластине с амфолином. Белки разделяются в зависимости от заряда (ИЭТ). Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы.

Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)

Аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце (рис 2.4).

Выделение белков из биологического материала.

Разделение белков по молекулярной массе методом электрофореза в ПААГ с ДДС-Na.

Перенос белков с геля на полимерную пластину с целью облегчения дальнейших работ.

Обработка пластины раствором неспецифического белка для заполнения оставшихся пор.

Таким образом, после этого этапа получена пластинка, в порах которой содержатся разделенные белки, а пространство между ними заполнено неспецифическим белком. Теперь надо выявить, есть ли среди белков искомый, ответственный за какое-то заболевание. Для выявления используют обработку антителами. Под первичными антителами понимают антитела к искомому белку. Под вторичными антителами понимают антитела к первичным антителам. В состав вторичных антител вводят дополнительно специальную метку (т.н. молекулярный зонд), чтобы потом можно было визуализировать результаты. В качестве метки используются радиоактивный фосфат или фермент, прочно связанные с вторичным антителом. Связывание сначала с первичными, а затем с вторичными антителами преследует две цели: стандартизация метода и улучшение результатов.

Обработка раствором первичных антител  связывание происходит в том месте пластины, где есть антиген (искомый белок).

Удаление несвязавшихся антител (промывка).

Обработка раствором меченых вторичных антител для последующей проявки.

Удаление несвязавшихся вторичных антител (промывка).

Рис. 2.4 . Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот)

В случае присутствия искомого белка в биологическом материале – на пластинке появляется полоса, свидетельствующая о связывании этого белка с соответствующими антителами.

Как известно, белки - основа зарождения жизни на нашей планете. По именно коацерватная капля, состоящая из молекул пептидов, стала основой зарождения живого. Это и не вызывает сомнений, ведь анализ внутреннего состава любого представителя биомассы показывает, что эти вещества есть во всем: растениях, животных, микроорганизмах, грибах, вирусах. Причем они очень разнообразны и макромолекулярны по природе.

Названий у этих структур четыре, все они являются синонимами:

• белки;
• протеины;
• полипептиды;
• пептиды.

Белковые молекулы

Их количество поистине неисчислимо. При этом все белковые молекулы можно разделить на две большие группы:

• простые - состоят только из аминокислотных последовательностей, соединенных пептидными связями;
• сложные - строение и структура белка характеризуются дополнительными протолитическими (простетическими) группами, называемыми еще кофакторами.

При этом сложные молекулы также имеют свою классификацию.

Градация сложных пептидов

1. Гликопротеиды - тесно связанные соединения белка и углевода. В структуру молекулы вплетаются простетические группы мукополисахаридов.
2. Липопротеиды - комплексное соединение из белка и липида.
3. Металлопротеиды - в качестве простетической группы выступают ионы металлов (железо, марганец, медь и другие).
4. Нуклеопротеиды - связь белка и нуклеиновых кислот (ДНК, РНК).
5. Фосфопротеиды - конформация протеина и остатка ортофосфорной кислоты.
6. Хромопротеиды - очень схожи с металлопротеидами, однако элемент, входящий в состав простетической группы, представляет собой целый окрашенный комплекс (красный - гемоглобин, зеленый - хлорофилл и так далее).

У каждой рассмотренной группы строение и свойства белков различны. Функции, которые они выполняют, также варьируются в зависимости от типа молекулы.

Химическое строение белков

С данной точки зрения протеины - это длинная, массивная цепь аминокислотных остатков, соединяющихся между собой специфическими связями, называемыми пептидными. От боковых структур кислот отходят ответвления - радикалы. Такое строение молекулы было открыто Э. Фишером в начале XXI века.

Позже более подробно были изучены белки, строение и функции белков. Стало ясно, что аминокислот, образующих структуру пептида, всего 20, но они способны комбинироваться самым разным способом. Отсюда и разнообразие полипептидных структур. Кроме того, в процессе жизнедеятельности и выполнения своих функций белки способны претерпевать ряд химических превращений. В результате они меняют структуру, и появляется уже совсем новый тип соединения.

Чтобы разорвать пептидную связь, то есть нарушить белок, строение цепей, нужно подобрать очень жесткие условия (действие высоких температур, кислот или щелочей, катализатора). Это объясняется высокой прочностью в молекуле, а именно в пептидной группе.

Обнаружение белковой структуры в условиях лаборатории проводится при помощи биуретовой реакции - воздействия на полипептид свежеосажденным (II). Комплекс пептидной группы и иона меди дает ярко-фиолетовую окраску.

Существует четыре основные структурные организации, каждая из которых имеет свои особенности строения белков.

Уровни организации: первичная структура

Как уже упоминалось выше, пептид - это последовательность аминокислотных остатков с включениями, коферментами или же без них. Так вот первичной называют такую структуру молекулы, которая является природной, естественной, представляет собой истинно аминокислоты, соединенные пептидными связями, и больше ничего. То есть полипептид линейного строения. При этом особенности строения белков такого плана - в том, что такое сочетание кислот является определяющим для выполнения функций белковой молекулы. Благодаря наличию данных особенностей возможно не только идентифицировать пептид, но и предсказать свойства и роль совершенно нового, еще не открытого. Примеры пептидов, обладающих природным первичным строением, - инсулин, пепсин, химотрипсин и другие.

Вторичная конформация

Строение и свойства белков этой категории несколько меняются. Такая структура может сформироваться изначально от природы либо при воздействии на первичную жестким гидролизом, температурой или иными условиями.

Данная конформация имеет три разновидности:

1. Ровные, правильные, стереорегулярные витки, построенные из остатков аминокислот, которые закручиваются вокруг основной оси соединения. Удерживаются вместе только возникающими между кислородом одной пептидной группировки и водородом другой. Причем строение считается правильным из-за того, что витки равномерно повторяются через каждые 4 звена. Такая структура может быть как левозакрученной, так и правозакрученной. Но в большинстве известных белков преобладает правовращающий изомер. Такие конформации принято называть альфа-структурами.
2. Состав и строение белков следующего типа отличается от предыдущего тем, что водородные связи образуются не между рядом стоящими по одной стороне молекулы остатками, а между значительно удаленными, причем на достаточно большое расстояние. По этой причине вся структура принимает вид нескольких волнообразных, извитых змейкой полипептидных цепочек. Есть одна особенность, которую должен проявлять белок. Строение аминокислот на ответвлениях должно быть максимально коротким, как у глицина или аланина, например. Этот тип вторичной конформации носит название бета-листов за способность будто слипаться при образовании общей структуры.
3. Относящееся к третьему типу строение белка биология обозначает как сложные, разноразбросанные, неупорядоченные фрагменты, не обладающие стереорегулярностью и способные изменять структуру под воздействием внешних условий.

Примеров белков, имеющих вторичную структуру от природы, не выявлено.

Третичное образование

Это достаточно сложная конформация, имеющая название "глобула". Что собой представляет такой белок? Строение его основывается на вторичной структуре, однако добавляются новые типы взаимодействий между атомами группировок, и вся молекула словно сворачивается, ориентируясь, таким образом, на то, чтобы гидрофильные группировки были направлены внутрь глобулы, а гидрофобные - наружу.

Этим объясняется заряд белковой молекулы в коллоидных растворах воды. Какие же типы взаимодействий здесь присутствуют?

1. Водородные связи - остаются без изменений между теми же самыми частями, что и во вторичной структуре.
2. взаимодействия - возникают при растворении полипептида в воде.
3. Ионные притяжения - образуются между разнозаряженными группами аминокислотных остатков (радикалов).
4. Ковалентные взаимодействия - способны формироваться между конкретными кислотными участками - молекулами цистеина, вернее, их хвостами.

Таким образом, состав и строение белков, обладающих третичной структурой, можно описать как свернутые в глобулы полипептидные цепи, удерживающие и стабилизирующие свою конформацию за счет разных типов химических взаимодействий. Примеры таких пептидов: фосфоглицераткеназа, тРНК, альфа-кератин, фиброин шелка и другие.

Четвертичная структура

Это одна из самых сложных глобул, которую образуют белки. Строение и функции белков подобного плана очень многогранны и специфичны.

Что собой представляет такая конформация? Это несколько (в некоторых случаях десятки) крупных и мелких полипептидных цепей, которые формируются независимо друг от друга. Но затем за счет тех же взаимодействий, что мы рассматривали для третичной структуры, все эти пептиды скручиваются и переплетаются между собой. Таким образом получаются сложные конформационные глобулы, которые могут содержать и атомы металлов, и липидные группировки, и углеводные. Примеры таких белков: ДНК-полимераза, белковая оболочка табачного вируса, гемоглобин и другие.

Все рассмотренные нами структуры пептидов имеют свои методы идентификации в лабораторных условиях, основанные на современных возможностях использования хроматографии, центрифугирования, электронной и оптической микроскопии и высоких компьютерных технологиях.

Выполняемые функции

Строение и функции белков тесно коррелируют друг с другом. То есть каждый пептид играет определенную роль, уникальную и специфическую. Встречаются и такие, которые способны выполнять в одной живой клетке сразу несколько значительных операций. Однако можно в обобщенном виде выразить основные функции белковых молекул в организмах живых существ:

1. Обеспечение движения. Одноклеточные организмы, либо органеллы, или некоторые виды клеток способны к передвижениям, сокращениям, перемещениям. Это обеспечивается белками, входящими в состав структуры их двигательного аппарата: ресничек, жгутиков, цитоплазматической мембраны. Если же говорить о неспособных к перемещениям клетках, то белки могут способствовать их сокращению (миозин мышц).
2. Питательная или резервная функция. Представляет собой накопление белковых молекул в яйцеклетках, зародышах и семенах растений для дальнейшего восполнения недостающих питательных веществ. При расщеплении пептиды дают аминокислоты и биологически активные вещества, которые необходимы для нормального развития живых организмов.
3. Энергетическая функция. Помимо углеводов, силы организму могут давать и белки. При распаде 1 г пептида высвобождается 17,6 кДж полезной энергии в форме аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), которая расходуется на процессы жизнедеятельности.
4. Сигнальная и Заключается в осуществлении тщательного контроля за происходящими процессами и передачи сигналов от клеток к тканям, от них к органам, от последних к системам и так далее. Типичным примером может служить инсулин, который строго фиксирует количество глюкозы в крови.
5. Рецепторная функция. Осуществляется путем изменения конформации пептида с одной стороны мембраны и вовлечения в реструктуризацию другого конца. При этом и происходит передача сигнала и необходимой информации. Чаще всего такие белки встраиваются в цитоплазматические мембраны клеток и осуществляют строгий контроль над всеми веществами, проходящими через нее. Также оповещают о химических и физических изменениях окружающей среды.
6. Транспортная функция пептидов. Ее осуществляют белки-каналы и белки-переносчики. Роль их очевидна - транспортировка необходимых молекул к местам с низкой концентрацией из частей с высокой. Типичным примером служит перенос кислорода и диоксида углерода по органам и тканям белком гемоглобином. Ими же осуществляется доставка соединений с невысокой молекулярной массой через мембрану клетки внутрь.
7. Структурная функция. Одна из важнейших из тех, которые выполняет белок. Строение всех клеток, их органелл обеспечивается именно пептидами. Они подобно каркасу задают форму и структуру. Кроме того, они же ее поддерживают и видоизменяют в случае необходимости. Поэтому для роста и развития всем живым организмам необходимы белки в рационе питания. К таким пептидам можно отнести эластин, тубулин, коллаген, актин, кератин и другие.
8. Каталитическая функция. Ее выполняют ферменты. Многочисленные и разнообразные, они ускоряют все химические и биохимические реакции в организме. Без их участия обычное яблоко в желудке смогло бы перевариться только за два дня, с большой вероятностью загнив при этом. Под действием каталазы, пероксидазы и других ферментов этот процесс происходит за два часа. В целом именно благодаря такой роли белков осуществляется анаболизм и катаболизм, то есть пластический и

Защитная роль

Существует несколько типов угроз, от которых белки призваны оберегать организм.

Во-первых, травмирующих реагентов, газов, молекул, веществ различного спектра действия. Пептиды способны вступать с ними в химическое взаимодействие, переводя в безобидную форму или же просто нейтрализуя.

Во-вторых, физическая угроза со стороны ран - если белок фибриноген вовремя не трансформируется в фибрин на месте травмы, то кровь не свернется, а значит, закупорка не произойдет. Затем, наоборот, понадобится пептид плазмин, способный сгусток рассосать и восстановить проходимость сосуда.

В-третьих, угроза иммунитету. Строение и значение белков, формирующих иммунную защиту, крайне важны. Антитела, иммуноглобулины, интерфероны - все это важные и значимые элементы лимфатической и иммунной системы человека. Любая чужеродная частица, вредоносная молекула, отмершая часть клетки или целая структура подвергается немедленному исследованию со стороны пептидного соединения. Именно поэтому человек может самостоятельно, без помощи лекарственных средств, ежедневно защищать себя от инфекций и несложных вирусов.

Физические свойства

Строение белка клетки весьма специфично и зависит от выполняемой функции. А вот физические свойства всех пептидов схожи и сводятся к следующим характеристикам.

1. Вес молекулы - до 1000000 Дальтон.
2. В водном растворе формируют коллоидные системы. Там структура приобретает заряд, способный варьироваться в зависимости от кислотности среды.
3. При воздействии жестких условий (облучение, кислота или щелочь, температура и так далее) способны переходить на другие уровни конформаций, то есть денатурировать. Данный процесс в 90% случаев необратим. Однако существует и обратный сдвиг - ренатурация.

Это основные свойства физической характеристики пептидов.